Cultivo in vitro de Jatropha curcas, L.(Euphorbiaceae). Resultados preliminares y estrategias futuras


Por Dariel López Hernández, Liuba Peñate Alvariño,
Marcos Daquinta Gradaille, Danilo Pina Morgado y Maritza Escalona Morgado*
* Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos.
Centro de Bioplantas, Universidad de Ciego de Ávila, Cuba.



Resumen
Se realizó una prospección de la planta en varias zonas del país. Dos variedades (africana y cubana) procedían de semillas colectadas en Guantánamo, y otras dos se colectaron por estacas en Ciego de Ávila; una fue seleccionada porque sus cápsulas tienen cuatro semillas. Actualmente tenemos en campo plantas de la variedad africana y el resto de las variedades se encuentra en las casas de plantas madres bajo condiciones controladas. Se quiere caracterizar botánica y agronómicamente las plantas con el objetivo de seleccionar los genotipos más productivos para la micropropagación.

El trabajo in vitro se realizó con material procedente de Guantánamo. Se evaluó la formación de callos en hojas, pecíolos e inflorescencias con el empleo de 6-benciladenina (BA) (0,5–2,0 mg/L) y 2,4-D, así como la germinación in vitro de la semilla. También se han evaluado diferentes procedimientos de desinfección para el establecimiento de ápices procedentes de plantas madres. De manera general se dan los primeros pasos en el establecimiento de un protocolo para la micropropagación y la transformación genética de esta planta.

Palabras clave: Jatropha curcas, organogénesis, callos, inflorescencias.

Introducción
El piñón de botija, como se conoce en Cuba la Jatropha curcas, L., es una especie perteneciente a la familia de las Euphorbiaceae, que crece en climas tropicales y semitropicales [Salas y Tello, 1994]. Esta planta tiene su origen en México y Centroamérica, aunque actualmente se cultiva en América Central, Sudamérica y África [Schmook, et al., 1997]. Es un arbusto que crece rápidamente, alcanza entre 3,5 y 4,5 m de altura, sobrevive en suelos pobres y es resistente a la sequía [Makkar y Becker, 1997]. Las hojas se presentan simples y alternas, con pecíolos de 5-35 cm de largo. Son subcorazonadas, redondeadas, angulosas o imperfectamente 3-5 lobuladas, de hasta 15 cm de ancho y de color verde oscuro por el haz y verde claro por el envés [Roig, 1965]. En la misma planta existen flores masculinas, femeninas y hermafroditas, de color amarillo verdoso, en las axilas de las hojas.

Cuando las hojas son pequeñas las flores generalmente están cubiertas por el follaje. La forma de los frutos es redonda, entre 2,5 y 4 cm de diámetro, y se encuentran envueltos en una especie de cápsula. Son verdes y carnosos cuando están inmaduros, pero se tornan carmelita oscuro una vez que maduran y se abren para liberar 2 o 3 semillas negras de forma oblongo-elipsoide y de 2 cm de largo y uno de ancho. Pesan alrededor de 0,75 g y contienen 30-32% de proteína y 60-66% de lípidos. Los rendimientos por hectáreas son susceptibles a las condiciones del suelo y a las lluvias, pero se plantea que en condiciones óptimas se puede producir hasta 5 toneladas de semillas [Makkar y Becker, 1999]. La carne de las semillas, blanca y aceitosa al tacto, tiene un sabor desagradable.

La reproducción natural de la Jatropha curcas, L. es por vía sexual, la que introduce una alta variabilidad genética con efectos negativos en un posterior uso agroindustrial. También se emplea la propagación por estacas, aunque tradicionalmente ha sido con el objetivo de utilizar el piñón de botija como cercas vivas.

En los últimos años ha habido un redescubrimiento de las bondades y los usos de esta especie, razón por la cual la Jatropha curcas, L. se encuentra actualmente en el centro de atención de las investigaciones que se desarrollan a nivel mundial en el área de los biocombustibles, como fuentes alternativas de energía. El aceite, que en tan alto porcentaje se extrae de las semillas, puede ser convertido en biodiésel mediante una reacción química de transesterificación y se plantea que una hectárea puede rendir hasta dos toneladas por año [Fiodl y Eder, 1997]. El material vegetal que resulta de este proceso industrial puede ser aprovechado como alimento animal (principalmente para aves) y fertilizante orgánico, otra característica que hace más atractivo el piñón de botija para estos fines.

Por otra parte, esta planta es utilizada para la reforestación de zonas afectadas por la sequía y la desertificación, gracias a su capacidad de crecer en zonas áridas o semiáridas, lo que puede ser una repuesta al dilema de si utilizar la tierra para la producción de alimentos o biocombustibles debido al uso de áreas marginales para las plantaciones de Jatropha curcas, L. Con este enfoque, la demanda de propágulos de esta especie comenzó a aumentar. Para ello se trazan grandes planes productivos que por los métodos de propagación por semilla se ven altamente afectados, por la no deseada variabilidad genética. Así, los métodos biotecnológicos constituyen una alternativa como herramienta para apoyar los métodos de reproducción asexual.

La micropropagación clonal implica que cada una de las plántulas que se producen puedan crecer y ser fenotípica y genotípicamente idénticas a la planta original de la que se derivan. Esto hace posible la selección y propagación de especies o variedades deseadas. Hasta el momento las puntas de tallos y las yemas naturales han sido los explantes más comúnmente utilizados para el establecimiento in vitro. Es por ello que cuando se usa la palabra micropropagación muy raras veces se piensa en el uso de callos, de células libres o de otros sistemas de tejidos más exigentes. Muy pocas investigaciones se han realizado en el campo del cultivo in vitro de Jatropha curcas, L. a pesar de ser este un género que comprende una amplia gama de especies de arbustos y árboles. La gran mayoría de estos estudios estuvieron confinados a la especie Jatropha panduraefolia y limitados al cultivo de endospermo [Johri y Srivastava, 1973; Srivastava y Johri, 1974], hasta que más recientemente otros autores incursionaron en la propagación in vitro de Jatropha integerrima [Sujatha y Dhingra, 1993]. En 1996, Sujatha y Mukta lograron la morfogénesis y la regeneración de plantas de la especie Jatropha curcas L, mediante el cultivo de tejidos.

Sin embargo, el protocolo se desarrolló por el método de formación de callos a partir de diferentes tipos de explantes como pecíolos y hojas [Sujatha y Mukta, 1996] lo cual trae consigo variabilidad genética. La propagación por vía biotecnológica, principalmente a partir de explantes de yemas de la Jatropha curcas, L.,es de marcado interés económico y ambiental para nuestro país. El empleo de técnicas de semiautomatización del proceso, como los biorreactores de Inmersión temporal, tiene un alto valor científico y práctico y permitirán la introducción masiva de genotipos seleccionados por su alto valor genético y de rendimiento de la semilla. Durante el año se desarrollaron las tareas siguientes:

  • Se realizó una prospección para la colecta de variedades con vistas a establecer un banco de germoplasma.
  • Se iniciaron los trabajos con vistas a establecer un protocolo para la micropropagación de esta especie, con el empleo de los métodos convencionales y los biorreactores de inmersión temporal, que permitieran la propagación masiva de los genotipos seleccionados.

Materiales y métodos
1. Colecta de variedades
En abril se visitó la provincia de Guantánamo y en coordinación con CATEDES se visitaron dos áreas en la Comunidad El Oro, de San Antonio del Sur, donde se había introducido esta planta en el marco del Programa de Lucha contra la Desertificación y la Sequía. Se colectaron semillas, estacas e inflorescencias de dos variedades: la Jatropha curcas, L. –variedad cubanay la variedad africana–, proveniente esta de Cabo Verde (Fig. 1).


Fig. 1: Variedades de
Jatropha curcas, L. que se colectaron
en la Comunidad El Oro de la provincia de Guantánamo.
Variedad cubana (izquierda) y variedad africana (derecha).

En otro viaje a la ciudad de Bartolomé Masó, de la provincia de Granma, se visitó una plantación de la variedad africana y se realizó una colecta de semillas. El material vegetal colectado se utilizó para los experimentos de cultivo in vitro, así como se estableció un área de plantas madres en bolsa y se procedió también a la siembra de 21 plantas en un área de la Estación Experimental Juan Tomás Roig que dará inicio al banco de germoplasma de la Jatropha curcas, L. Se colectó estacas de una variedad local en las cercanías del Centro de Bioplantas y recientemente de otra de las cercanías de Falla, por la particularidad de que sus cápsulas tienen cuatro semillas, ambas se mantienen en bolsas en el área de plantas madre.

2. Cultivo in vitro de la Jatropha curcas, L.

  • Evaluación del tipo de explante y la concentración de 6-benciladenina (BA) en la formación de callos de dos variedades de Jatropha curcas, L.

Se evaluaron tres tipos de explantes (hojas, pecíolos e inflorescencias) así como las siguientes concentraciones de BA (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg·L-1) en la formación de callos en las dos variedades de Jatropha curcas, L. La desinfección se realizó según el procedimiento descrito por Sujatha y Mukta [1996]. A los 30 días se determinó el porcentaje de formación de callos.

  • Efecto del ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) en la formación de callos de dos variedades de Jatropha curcas, L.

En este experimento se utilizó solo como explantes las hojas, las cuales fueron desinfectadas como se señaló en el experimento anterior. Se ensayaron las siguientes concentraciones de 2,4-D (0; 4,0; 8,0; 12,0 mg·L-1). A los 30 días se evaluó el porcentaje de formación de callos.

  • Desinfección de semillas de Jatropha curcas, L. –variedad cubana–. Se evaluaron diferentes tiempos de desinfección (0; 5; 10; 15 min) con el empleo de hipoclorito de calcio a la concentración de 0,5%. A los 22 días se evaluó el porcentaje de semillas germinadas y de semillas contaminadas.
  • Efecto de diferentes concentraciones de sales MS en la germinación in vitro de dos variedades de Jatropha curcas, L.

Se ensayaron las siguientes concentraciones de sales del medio MS: 25, 50, 75 y 100%. Las semillas se desinfectaron con hipoclorito de calcio a 0,5% durante 15 minutos.

Resultados
1. Colecta de variedades
En el banco de germoplasma de la Estación Experimental se cuenta con 21 plantas de la variedad africana procedente de semillas que se colectaron en la comunidad El Oro, de la provincia de Guantánamo. Una de estas plantas floreció y fructificó a los seis meses de plantadas. Se colectaron nueve frutos de tres semillas cada uno; además, se pudo evaluar que la planta posee las características fenotípicas deseadas por los agricultores en sus plantaciones. Como la planta posee flores unisexuales que abren a distintas horas, la polinización, que es por insectos, tiende a ser cruzada, por lo que se espera que aumente la producción en el próximo ciclo reproductivo, cuando florezcan más individuos de la población y esté fisiológicamente más madura. Se desea caracterizar botánica y agronómicamente las variedades que poseemos, así como las que podamos adquirir, con el objetivo de seleccionar y mejorar las variedades de mayor productividad y resistencia para desarrollar su cultivo.

2. Evaluación del tipo de explante y la concentración de 6-benciladenina (BA) en la formación de callos de dos variedades de Jatropha curcas, L.
La formación de callos en la variedad cubana tuvo un comportamiento dependiente del tipo de explante y de la concentración de BA. El pecíolo logró 100% de formación de callos a 0,5 y 1,5 mg/L. La respuesta de las hojas fue baja (36-50%) y las inflorescencias no respondieron a ninguna de las concentraciones de BA que se ensayaron (Fig. 2).


Fig. 2. Porcentaje de formación de callo a partir de diferentes
explantesde
Jatropha curcas, L. –variedad cubana–
expuestos a diferentes concentraciones de BA.

La morfología del callo que se obtuvo fue friable y de color blanquecino, y se formó a partir de la zona de corte tanto para las hojas como para los pecíolos (Fig. 3).


Fig. 3. Callos de
Jatropha curcas, L. –variedad cubana–, a partir de inflorescencia, pecíolos y hojas a los 30 días de estar expuestos a BA.

En la variedad africana fue mayor el nivel de respuesta a la formación de callos por los tres explantes que se utilizaron. El 50% de las inflorescencias formaron callos a la máxima concentración de BA (2 mg/L); a esa concentración el ciento por ciento de los pecíolos y las hojas también formaron callos. Sorprendentemente, los pecíolos no respondieron a la concentración de 1 y 1,5 mg/L de BA. Las hojas lograron 100% de formación de callos en todas las concentraciones, con excepción de la concentración de 1,5 mg/L (Fig. 4).


Fig. 4. Porcentaje de formación de callos a partir de diferentes explantes de
Jatropha curcas, L. –variedad africana–, expuestos a diferentes concentraciones de BA.

El callo que se formó a partir de las hojas y pecíolos mostró una morfología similar a la variedad cubana. Se caracterizó por una masa indiferenciada de color blanquecino algo friable. Las inflorescencias mostraron un tipo de callo nodular compacto morfológicamente diferente a las hojas y pecíolos (Fig. 5).


Fig. 5. Callos de
Jatropha curcas, L. –variedad africana–, a partir de inflorescencia, pecíolos y hojas a los 30 días de estar expuestos a BA.

En la figura 6 se compara en las dos variedades la cantidad de masa indiferenciada de células que presentaron las hojas expuestas a la misma concentración de BA y con el mismo tiempo de cultivo; es evidente que en la variedad africana el nivel de respuesta fue mayor. Sujatha y Mukta [1996] lograron la formación de callos y la regeneración de brotes adventicios a partir de callos formados de hipocótilos y hojas de Jatropha curcas, L. con 0,5 mg/L de BA y 1 mg/L de AIB. Sin embargo, los pecíolos requieren concentraciones mas bajas de estos reguladores (0,1 mg/L de BA y 0,1 mg/L de AIB) continúan señalando estos autores. En la literatura consultada no se encontraron trabajos de formación de callos en esta especie a partir de inflorescencias inmaduras, por lo cual resulta sumamente interesante continuar estos trabajos.


Fig. 6. Formación de callos en las dos variedades de
Jatropha curcas,
L. en el medio de cultivo MS con 1,0 mg/L de BA, a partir de hojas.

3. Efecto del ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) en la formación de callos de dos variedades de Jatropha curcas, L.
Las dos variedades mostraron diferente comportamiento a las tres concentraciones de 2,4-D que se ensayaron. En la variedad cubana la formación de callo fue baja y nula a la mayor concentración, mientras que en la variedad africana se logró 100% de formación de callos a las tres concentraciones de auxina (Fig. 7).


Fig. 7. Porcentaje de formación de callos en las dos variedades de
Jatropha curcas,
L. a partir de hojas expuestas a diferentes concentraciones de 2,4-D.

La morfología del callo en las dos variedades que se cultivaron en medio suplementado con 2,4-D se muestra en la figura 8. El tipo de callo que se presentó en ambas variedades fue de color amarillo claro con consistencia y del tipo nodular compacto. Aunque Baran, et al., [2007] lograron la formación de callos nodulares con similares características a las obtenidas en el presente trabajo a partir de explantes de hojas, pero con kinetina.


Fig. 8. Callos de
Jatropha curcas, L. a partir de hojas
a la concentración de 2,4-D de 12 mg/L.

4. Desinfección de semillas de Jatropha curcas, L. –variedad cubana
Las semillas de Jatropha curcas, L.lograron un alto porcentaje de germinación in vitro. Sin embargo, los porcentajes de contaminación más bajos (45%) se logró con tiempos de exposición al desinfectante de 15 minutos (Fig. 9).


Fig. 9. Porcentaje de semillas de Jatropha curcas, L. –variedad cubana–
que germinaron y se contaminaron a los 22 días de desinfectadas
con hipoclorito de calcio a diferentes tiempos de desinfección.

En la figura 10 se muestra la presencia de contaminantes del tipo bacteriano a los tiempos de 5 y 10 minutos mientras que a los 15 minutos se observa una germinación completa de la semilla sin la presencia de contaminantes visibles.

Fig. 10. Germinación in vitro de semillas de Jatropha curcas, L. –variedad cubana–
en medio MS después de 22 días de cultivo. El hipoclorito de calcio, al igual que
el de sodio, se emplea ampliamente como desinfectante, por diversos autores.
En la literatura se señala indistintamente el uso de hipoclorito de sodio y de calcio;
su empleo depende fundamentalmente de la disponibilidad y no de la efectividad. Considerando y analizando los resultados se puede plantear que no necesariamente
la eficiencia en la desinfección trae consigo una buena calidad del material restante, pues al emplear la mayor concentración se daña la superficie del explante, disminuyendo la germinación. Santos-Díaz [2003], en su trabajo con dos especies
de cactus empleó hipoclorito de calcio al 2% y en inmersiones de 15 a 20 minutos,
con un rango de 20% de contaminación. También se puede recurrir a procesos
de doble desinfección, como los mencionados por Roca y Mronginski [1991].

5. Efecto de diferentes concentraciones de sales MS en la germinación in vitro de dos variedades de Jatropha curcas, L.
En las figuras 11 y 12 se muestra el efecto de la concentración salina del medio MS en la germinación in vitro de semillas de las dos variedades de Jatropha curcas, L. En la variedad cubana una concentración en sales de 75% provocó porcentajes de germinación de 70%. En la variedad africana los porcentajes de germinación fueron inferiores a 50% y el mayor porcentaje de germinación se alcanzó cuando la concentración de sales del medio MS se redujo a 25%.


Fig. 11. Efecto de la concentración de sales del medio
MS en el porcentaje
de germinación de semillas de
Jatropha curcas, L. –variedad cubana–.


Fig. 12. Efecto de la concentración de sales del medio
MS en el porcentaje
de germinación de semillas de
Jatropha curcas, L. –variedad africana–.

Conclusiones
1. Se logro el establecimiento de semillas de Jatropha curcas, procedentes de Guantánamo y Cabo Verde.
2. Se iniciaron los trabajos de inducción de callos con vistas a establecer un protocolo de propagación in vitro a partir de diferentes explantes de Jatropha curcas.

Bibliografía
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